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流式細(xì)胞術(shù)與流式細(xì)胞儀FCM的測試應(yīng)用場景
來源： 時(shí)間：2022-12-06 11:45:58 瀏覽：11783次

流式細(xì)胞術(shù)(Flow Cytometry, FCM)是七十年代發(fā)展起來的高科學(xué)技術(shù),它集計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算技術(shù)、激光技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)于一體, 同時(shí)具有分析和分選細(xì)胞功能。它不僅可測量細(xì)胞大小、內(nèi)部顆粒的性狀,還可檢測細(xì)胞表面和細(xì)胞漿抗原、細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA含量等,可對群體細(xì)胞在單細(xì)胞水平上進(jìn)行分析, 在短時(shí)間內(nèi)檢測分析大量細(xì)胞,并收集、儲存和處理數(shù)據(jù),進(jìn)行多參數(shù)定量分析; 能夠分類收集(分選)某一亞群細(xì)胞,分選純度＞95%。在血液學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、藥物學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科廣泛應(yīng)用。

流式細(xì)胞儀FCM

流式細(xì)胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計(jì)算機(jī)等高技術(shù)發(fā)展起來的一種先進(jìn)儀器，已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細(xì)胞表面標(biāo)志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細(xì)胞群和亞群進(jìn)行精確分類，還能分離純化某一群或亞群細(xì)胞?；罴?xì)胞免疫熒光技術(shù)是用于FCM檢測的標(biāo)本準(zhǔn)備，染色后也能在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，在某些實(shí)驗(yàn)條件下，活細(xì)胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的結(jié)果。


流式細(xì)胞儀技術(shù)，主要是測量群體中單個(gè)細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)染色后其成分所發(fā)出的散射光和熒光，經(jīng)染色的細(xì)胞在懸液中以單行流過高強(qiáng)度光源的焦點(diǎn)，當(dāng)每個(gè)細(xì)胞經(jīng)過焦點(diǎn)時(shí)，發(fā)出一束散射光/或熒光。它們經(jīng)過過濾及光鏡系統(tǒng)收集到達(dá)一個(gè)光電檢測器(光電倍增管或一個(gè)固態(tài)裝置)，光檢測器把散射光定量轉(zhuǎn)化成電信號，經(jīng)數(shù)字轉(zhuǎn)換器進(jìn)行數(shù)字化后而成整數(shù)，然后進(jìn)行電子存儲，以后數(shù)據(jù)可以調(diào)出顯示和進(jìn)行分析。其優(yōu)點(diǎn)如下：


1、具有操作簡便，只要將染色的單個(gè)細(xì)胞推入儀器中，就會得出數(shù)據(jù)。
2、具有較高的靈敏度及測定速度，而且每次可測出許多數(shù)據(jù)，一般情況下，每秒可測5000個(gè)細(xì)胞，能迅速分析和記數(shù)大量細(xì)胞，并能準(zhǔn)確統(tǒng)計(jì)群體中熒光標(biāo)記細(xì)胞的比例。
3、應(yīng)用廣泛，即可用于測定細(xì)胞活力、繁殖周期和細(xì)胞定型分析，也可區(qū)別死亡細(xì)胞、分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群，既可測定DNA和RNA、測凋亡峰，又可測蛋白含量，特別是胞漿蛋白。
國內(nèi)使用的流式細(xì)胞儀主要由美國的兩個(gè)廠家生產(chǎn):BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(簡稱B-D公司)。流式細(xì)胞儀主要有兩型:臨床型（又稱小型機(jī)、臺式機(jī)）和綜合型（又稱大型機(jī)、分析型）。ECKMAN-COULTER公司的產(chǎn)品為EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL等, B-D公司最新產(chǎn)品為FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是臨床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是綜合型，除具備檢測分析功能外,還具有細(xì)胞分選功能,多用于科學(xué)研究。

流式細(xì)胞儀

流式細(xì)胞儀主要由以下五部分構(gòu)成:①流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng)②激光光源及光束形成系統(tǒng)③光學(xué)系統(tǒng)④信號檢測與存儲、顯示、分析系統(tǒng)⑤細(xì)胞分選系統(tǒng)。

主要技術(shù)指標(biāo)


1．流式細(xì)胞儀的分析速度：
一般流式細(xì)胞儀每秒檢測1000～ 5000個(gè)細(xì)胞,大型機(jī)可達(dá)每秒上萬個(gè)細(xì)胞。
2．流式細(xì)胞儀的熒光檢測靈敏度：一般能測出單個(gè)細(xì)胞上<600個(gè)熒光分子,兩個(gè)細(xì)胞間的熒光差＞5%即可區(qū)分。
3．前向角散射（FSC）光檢測靈敏度：前向角散射（FSC）反映被測細(xì)胞的大小,一般流式細(xì)胞儀能夠測量到0.2μm～０.5μm。
4．流式細(xì)胞儀的分辨率：通常用變異系數(shù)CV值來表示，,一般流式細(xì)胞儀能夠達(dá)到<2.0%,這也是測量標(biāo)本前用熒光微球調(diào)整儀器時(shí)要求必須達(dá)到的。
5．流式細(xì)胞儀的分選速度：一般流式細(xì)胞儀分選速度＞1000個(gè)/秒，分選細(xì)胞純度可達(dá)99%以上。
?  主要構(gòu)造和工作原理：流動室及液流驅(qū)動系統(tǒng) 編輯本段回目錄流動室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式細(xì)胞儀的核心部件，流動室由石英玻璃制成，單細(xì)胞懸液在細(xì)胞流動室里被鞘流液包繞通過流動室內(nèi)的一定孔徑的孔,檢測區(qū)在該孔的中心，細(xì)胞在此與激光垂直相交，在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)。流動室里的鞘液流是一種穩(wěn)定流動，控制鞘液流的裝置是在流體力學(xué)理論的指導(dǎo)下由一系列壓力系統(tǒng)、壓力感受器組成，只要調(diào)整好鞘液壓力和標(biāo)本管壓力, 鞘液流包繞樣品流并使樣品流保持在液流的軸線方向，能夠保證每個(gè)細(xì)胞通過激光照射區(qū)的時(shí)間相等，從而使激光激發(fā)的熒光信息準(zhǔn)確無誤。流動室孔徑有60μm、100μm、150μm 、250μm等多種，供研究者選擇。小型儀器一般固定裝置了一定孔徑的流動室。

主要構(gòu)造和工作原理：激光光源及光束形成系統(tǒng)


    流式細(xì)胞儀可配備一根或多根激光管，常用的激光管是氬離子氣體激光管，它的發(fā)射光波長488ηm,此外可配備氦氖離子氣體激光管（波長633ηm）和/或紫外激光管。


流式細(xì)胞儀的主要測定信號熒光是由激發(fā)光激發(fā)的，熒光信號的強(qiáng)弱與激發(fā)光的強(qiáng)度和照射時(shí)間相關(guān)，激光是一種相干光源,它能提供單波長、高強(qiáng)度、高穩(wěn)定性的光照，正是能達(dá)到這一要求的理想的激發(fā)光光源。


    在激光光源和流動室之間有兩個(gè)圓柱形透鏡，將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束(22μm×66μm)，在這種橢圓形激光光斑內(nèi)激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致。

主要構(gòu)造和工作原理：光學(xué)系統(tǒng)

    流式細(xì)胞儀的光學(xué)系統(tǒng)由若干組透鏡、小孔、濾光片組成，大致可分為流動室前和流動室后兩組。流動室前的光學(xué)系統(tǒng)由透鏡和小孔組成，透鏡和小孔（一般為2片透鏡、1個(gè)小孔）的主要作用是將激光光源發(fā)出的橫截面為圓形的激光光束聚焦成橫截面較小的橢圓形激光光束，使激光能量成正態(tài)分布，使通過激光檢測區(qū)的細(xì)胞受照強(qiáng)度一致，最大限度的減少雜散光的干擾；流動室后的光學(xué)系統(tǒng)主要由多組濾光片組成，濾光片的主要作用是將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管。濾光片主要有三類：長通濾片（LP）--只允許特定波長以上的光線通過，短通濾片(SP)-- 只允許特定波長以下的光線通過，帶通濾片(BP)-- 只允許特定波長的光線通過，不同組合的濾片可以將不同波長的熒光信號送到不同的光電倍增管(PMT),如接收綠色熒光(FITC)的PMT前面配置的濾光片是LP550和BP525, 接收色橙紅色熒光(PE)的PMT前面配置的濾光片是LP600和BP575, 接收紅色熒光(CY5)的PMT前面配置的濾光片是LP650和BP675。

主要構(gòu)造和工作原理：信號檢測系統(tǒng)


    當(dāng)測定標(biāo)本在鞘流液約束下細(xì)胞成單行排列依次通過激光檢測區(qū)時(shí)產(chǎn)生散射光和熒光信號,散射光分為前向角散射（Forward Scatter, FS）和側(cè)向角散射或900散射（Side Scatter, SS）,散射光是細(xì)胞的物理參數(shù)與細(xì)胞樣本的制備（如染色）無關(guān);熒光信號也有兩種,一種是細(xì)胞自發(fā)熒光它一般很微弱,一種是細(xì)胞樣本經(jīng)標(biāo)有特異熒光素的單克隆抗體染色后經(jīng)激光激發(fā)發(fā)出的熒光，它是我們要測定的熒光,熒光信號較強(qiáng),這兩種熒光信號的同時(shí)存在是我們測定時(shí)需要設(shè)定陰性對照的理由,以便從測出的熒光信號中減去細(xì)胞自發(fā)熒光和抗體非特異結(jié)合產(chǎn)生的熒光。
前向角散射（FS）反映被測細(xì)胞的大小,它由正對著流動室的光電二極管裝置接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘枺粋?cè)向角散射或900散射（SS）反映被測細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、核膜的折射率和細(xì)胞內(nèi)顆粒的性狀, 它由一個(gè)光電倍增管(PMT) 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?這些電信號存儲在流式細(xì)胞儀的計(jì)算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi)。
流式細(xì)胞儀測定常用的熒光染料有多種,他們分子結(jié)構(gòu)不同,激發(fā)光譜和發(fā)射光譜也各異,選擇熒光染料時(shí)必須依據(jù)流式細(xì)胞儀所配備的激光光源的發(fā)射光波長(如氬離子氣體激光管,它的發(fā)射光波488ηm,氦氖離子氣體激光管發(fā)射光波長633ηm）。488ηm激光光源常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）、CY5（化青素）、preCP(葉綠素蛋白)、ECD(藻紅蛋白-得克薩斯紅)等。他們的激發(fā)光和發(fā)射光波長分別是：
 激發(fā)光波長（ηm） 發(fā)射光峰值（ηm）
FITC 488 525（綠）
PE 488 575（橙紅）
PI 488 630（橙紅）
ECD 488 610（紅）
CY5 488 675（深紅）
PreCP 488 675（深紅）
各種熒光信號由各自的光電倍增管(PMT) 接收并轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柡蟠鎯υ诹魇郊?xì)胞儀的計(jì)算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi)。

主要構(gòu)造和工作原理：信號存儲、顯示、分析系統(tǒng)

(一) 信號存儲
存儲在流式細(xì)胞儀的計(jì)算機(jī)硬盤或軟盤內(nèi)的數(shù)據(jù)一般是以List mode(列表排隊(duì))方式存入的,采用List mode方式有兩大優(yōu)點(diǎn):①節(jié)約內(nèi)存和磁盤空間②易于加工處理分析。
（二）信號顯示和分析
由于List mode方式數(shù)據(jù)缺乏直觀性，數(shù)據(jù)的顯示和分析一般采用一維直方圖、二維點(diǎn)陣圖、等高線圖和密度圖。
1．單參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的每一個(gè)單參數(shù)測量數(shù)據(jù)用直方圖來顯 示，圖中橫坐標(biāo)表示散射光或熒光信號相對強(qiáng)度值，其單位是道數(shù)，可以是線性的，也可以是對數(shù)的；縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù)。一維直方圖橫坐標(biāo)是FITC熒光信號相對強(qiáng)度值（對數(shù)），縱坐標(biāo)表示細(xì)胞數(shù);圖中已根據(jù)陰性對照設(shè)定適當(dāng)?shù)摹伴T”（直線門），儀器的計(jì)算機(jī)就會給出測定值（包括陽性細(xì)胞%和平均熒光強(qiáng)度）。
2.雙參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的雙參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系用一維直方圖、二維點(diǎn)陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。
3．三參數(shù)數(shù)據(jù)顯示和分析  細(xì)胞的三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量的關(guān)系每兩個(gè)數(shù)據(jù)組成一對（三參數(shù)測量數(shù)據(jù)和細(xì)胞數(shù)量每兩個(gè)數(shù)據(jù)可組成6對數(shù)據(jù)）用一維直方圖、二維點(diǎn)陣圖、等高線圖和密度圖顯示和分析。三個(gè)熒光數(shù)據(jù)關(guān)系用分光圖（prism）表示，分光圖可直接給出8個(gè)數(shù)據(jù)（如用ABC代表3種熒光，可有A+B+C+、A+B+C- 、A+B-C-、 A-B+C+、 A-B+C-、 A-B-C+、 A+B-C+ 、A-B-C-）。
?  主要構(gòu)造和工作原理：細(xì)胞分選系統(tǒng) 編輯本段回目錄 如在細(xì)胞流動室上裝有超聲壓電晶體,通電后超聲壓電晶體發(fā)生高頻震動，可帶動細(xì)胞流動室高頻震動,使細(xì)胞流動室噴咀流出的液流束斷成一連串均勻的液滴, 每秒鐘形成液滴上萬個(gè)。每個(gè)液滴中包含著一個(gè)樣品細(xì)胞,液滴中的細(xì)胞在形成液滴前已被測量,如符合預(yù)定要求則可被充電,在通過偏轉(zhuǎn)板的高壓靜電場時(shí)向左或向右偏轉(zhuǎn)被收集在指定容器中,不含細(xì)胞液滴或細(xì)胞不符合預(yù)定要求液滴不被充電亦不發(fā)生偏轉(zhuǎn)進(jìn)入中間廢液收集器中,從而實(shí)現(xiàn)了分選。

活體流式細(xì)胞儀(In vivo Flow Cytometer, IVFC)

 活體流式細(xì)胞儀(In vivo Flow Cytometer, IVFC) 是一種新的生物醫(yī)學(xué)光學(xué)儀器，結(jié)合活體（近紅外）實(shí)時(shí)高速影像方法和體外流式細(xì)胞儀的概念，可實(shí)時(shí)檢測活體CTC并可以進(jìn)行定量分析與檢/監(jiān)測，可用于實(shí)驗(yàn)室對腫瘤治療效果的早期實(shí)時(shí)監(jiān)測及評估，藥物的早期篩選等。
  IVFC技術(shù)原理是：帶有熒光標(biāo)記的癌細(xì)胞在流動過程中經(jīng)過放置于血管某處橫截面的一束激光，其受激發(fā)射的熒光信號通過光電轉(zhuǎn)換和模/數(shù)轉(zhuǎn)換在計(jì)算機(jī)中儲存，通過一段時(shí)間內(nèi)檢測熒光信號來實(shí)時(shí)記錄循環(huán)系統(tǒng)中流過的癌細(xì)胞的數(shù)量。這種方法主要的特點(diǎn)是不用抽血，可在血管中檢測，屬于微創(chuàng)體內(nèi)診斷方法。


浮游植物流式細(xì)胞儀利用流式細(xì)胞測量技術(shù)，在野外現(xiàn)場快速對水體中的浮游植物進(jìn)行計(jì)數(shù)的儀器。與傳統(tǒng)的生物醫(yī)學(xué)流式細(xì)胞儀相比，具有如下顯著特點(diǎn)。
  1）細(xì)胞粒徑范圍大，可測量0.4 um－4000 um間的浮游植物，幾乎覆蓋自然界的所有浮游植物粒徑范圍
  2）檢測器強(qiáng)大，目前一臺標(biāo)準(zhǔn)的浮游植物流式細(xì)胞儀CytoBuoy配備6種檢測器：前向光散射（FSC）、側(cè)向光散射（SSC）、紅色熒光、綠色熒光、橙色熒光和曲度檢測器?？梢詫Ω∮沃参镞M(jìn)行分類。
  3）堅(jiān)固、耐用、輕便，適合野外現(xiàn)場測量，而傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀非常笨重，只能實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用。
  4）樣品不需任何前處理，可以直接測量。傳統(tǒng)的流式細(xì)胞儀前處理復(fù)雜，處理不好就會阻塞管路。
  5）不需外加鞘液，儀器自動采用水樣的濾液為鞘液，維護(hù)方便。
  6）多版本可選。有便攜式機(jī)型CytoSense、在線監(jiān)測型CytoBuoy和水下型CytoSub。
  7）可建立浮游植物專家?guī)欤蓪ψ匀唤缢畼又械奶攸c(diǎn)浮游植物（如易引發(fā)赤潮的硅藻和甲藻）鑒定到種，進(jìn)行早期預(yù)警
  8）新增成像功能，可拍攝特定細(xì)胞的顯微照片。

流式細(xì)胞術(shù)Protocal

一、樣品的制備

流式細(xì)胞儀是測定一個(gè)或重復(fù)的每個(gè)顆粒經(jīng)光路的信號，因此，細(xì)胞必須做成單個(gè)細(xì)胞懸浮狀態(tài)，不能聚集，也不允許有細(xì)胞碎片存在。所用染料必須特異（如特異單抗），而且不允許滲透至載液中。
標(biāo)本如果是屬于淋巴細(xì)胞等血細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或白血病細(xì)胞系或類淋巴細(xì)胞系，要經(jīng)Ficoll分離，作單細(xì)胞分離處理，但若為實(shí)體組織或貼壁生長的上皮成纖維樣細(xì)胞，需采用酶消化法(胰蛋白酶、膠原酶等)，化學(xué)法（EDTA、EGTA和檸檬酸鹽）消化分散液或洗液最好用無鈣、鎂PBS，檸檬酸鹽的濃度為40μmol/L，并同時(shí)采用機(jī)械分散法，將經(jīng)消化處理的膨松組織，用玻璃珠懸搖或用吸管吹打分散均可，用PBS洗2～3次后重懸，最好過一下尼龍或不銹鋼網(wǎng)篩100μm和20μm。細(xì)胞濃度要保證在1-2×106/mL
若標(biāo)本用于測定單個(gè)細(xì)胞，需加入1～5 mg/L的DNAase，將有助于阻止破碎細(xì)胞釋放的DNA造成細(xì)胞再聚集，但是若分離的細(xì)胞要作DNA含量測定之用時(shí)，則切勿加DNAase。
二、懸浮細(xì)胞的固定

上述制備的活細(xì)胞即可用于流式細(xì)胞儀分析，如果染色和流式分析要拖后進(jìn)行，或?yàn)榱颂岣呷旧Ч?，則要將細(xì)胞預(yù)固定。乙醇固定是常用的方法。
1、固定方法：
(1)甲醛法：在細(xì)胞懸液中加入等量的8%甲醛(用Hank'S液配)4℃下固定12-18小時(shí)。
(2)乙醇法：細(xì)胞懸于PBS中，緩慢加入-20℃預(yù)冷的95%乙醇，使終濃度為70%，冰浴30分鐘。
(3)丙酮法：于細(xì)胞懸液中，緩慢加入冷丙酮，使終濃度為85%。
2、實(shí)例：
(1)用預(yù)冷的無鈣、鎂含0.5mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液，將細(xì)胞制成1×106細(xì)胞的懸液。
(2)在4℃下逐滴加入3倍體積的95%乙醇，連續(xù)攪拌使乙醇終濃度達(dá)70%。
(3)該細(xì)胞可在4℃下保存數(shù)日。
(4)分析前先用1000r/min離心10分鐘，棄去乙醇，再將細(xì)胞懸于PBS中或要求的試劑中。
三、流式細(xì)胞儀分析的應(yīng)用

(一)非染色細(xì)胞的光散射
一個(gè)粒子(如細(xì)胞)出現(xiàn)在一束光線中，立即會干擾該光束，造成該光束入射光的重分布，該細(xì)胞所獲能量則以衍散、折射、反射等復(fù)雜的參數(shù)形式重新發(fā)射出來，這些參數(shù)與細(xì)胞體積、表面構(gòu)象、內(nèi)部結(jié)構(gòu)形成函數(shù)關(guān)系，可測低角前面約10°的光散射及90°的光散射。
一般認(rèn)為，90°位置的光散射值主要受細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)所致的光反射和折射影響，而低角前面10°位置的光散射則主要代表細(xì)胞大小。光散射測量方法如下：
(1)將細(xì)胞懸浮于HBSS中，濃度介于1×106～2×106/mL濃度之間。
(2)以懸浮細(xì)胞平衡鹽溶液(HBSS)充滿含鞘液的細(xì)胞貯藏池。
(3)設(shè)定細(xì)胞流量為500個(gè)/S(秒)，以獲得最佳測定結(jié)果。
(二)染色法
1  細(xì)胞的碘化丙錠(propiolium iodide PI)染色
PI和EB(溴化乙錠)為同類物質(zhì)，與EB一樣，PI嵌入DNA雙螺旋中，可使熒光強(qiáng)度增加約20倍，PI的熒光強(qiáng)度約為EB染色的1.8倍，以488nm波長激發(fā)，DNA/PI復(fù)合物最大的發(fā)射波長約為615nm。
1.1  小鼠Lewis肺癌細(xì)胞(3LL)DNA含量測定方法
(1)從C57BL/6小鼠上切除腫塊，在培養(yǎng)皿內(nèi)用PBS沖洗；
(2)去除結(jié)締組織及脂肪，剪碎腫塊；
(3)小碎片移入1.20×38mm注射針,加壓使其通過,于4℃條件下重懸細(xì)胞于HBSS中。
(4)將200～300μL細(xì)胞懸液(5×105細(xì)胞/mL)中加入3mL PI(50μg/mL)，染色3LL細(xì)胞，于4℃存放20～30分鐘。
(5)測定580～750nm之間的發(fā)射熒光，以去除末結(jié)合PI產(chǎn)生的激發(fā)光與發(fā)射光譜線之間的重疊部分。
注：PI染色液：0.1%檸檬酸鈉1000mL+PI5mg+1%Nonide P40水。
1.2  培養(yǎng)細(xì)胞DNA的流式細(xì)胞儀分析
(1)從培養(yǎng)皿中吸去培養(yǎng)基，以HBSS沖洗二次；
(2)加入PI5mL于培養(yǎng)皿中，在4℃放10分鐘；
(3)用吸管反復(fù)次打細(xì)胞，使細(xì)胞破壞，胞核釋放出來，再行流式細(xì)胞儀分析。
1.3  完整細(xì)胞DNA的PI染色
(1)70%乙醇固定的細(xì)胞懸液，離心，去固定液；
(2)室溫條件下加入PI染色一批細(xì)胞（105～106細(xì)胞/mL），時(shí)間為30分鐘，然后行流式細(xì)胞儀分析。
1.4  光輝霉素和PI的DNA染色
在熒光抗生素光輝霉素和PI聯(lián)合染色過程中，光輝霉素的供體分子被PI的受體分子接受產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，該染色技術(shù)主要用于實(shí)體腫瘤組織，精子細(xì)胞及婦科標(biāo)本，同時(shí)也適用于體外培養(yǎng)的細(xì)胞。
(1)分離制備的細(xì)胞懸液即可使用，若用70%乙醇固定可保存一周。
(2)以PI/光輝霉素染色，4℃1小時(shí)（PI為10 mg/L、光輝霉素為10 mg/L）。
(3)染色后進(jìn)樣，以100W汞燈作為激光光源，使用BG123nm阻斷濾片，疊加K590型高通濾法(one seep filter)。
2、DNA和RNA的鑒別染色
利用吖啶橙的變色特性可鑒別DNA和RNA。吖啶橙作為一種熒光染料已被用于染色固定，非固定細(xì)胞核酸，或作溶酶體的一種標(biāo)記。觀察死亡細(xì)胞熒光變色性變化以及區(qū)別分裂細(xì)胞和靜止細(xì)胞群體。雖然測定DNA和RNA含量時(shí)較難獲得好的重復(fù)性結(jié)果，但該方法已被許多實(shí)驗(yàn)室廣泛采用。方法如下：
(1)試劑：
溶液A：低溫保存，穩(wěn)定期約2周。
Triton X-100(0.1%) 0.1mL，1mol/L HCL  8mL
1mol/L NacL 15ml蒸餾水76mL，PH1.5（100mL）
溶液B：穩(wěn)定期數(shù)月，最好除菌以后(高壓或過濾)貯存。
0.01mol/L EDTA10mL,1mol/L Nacl15mL
0.4mol/L Na2HPO4 31.5mL,0.2mol/L檸檬酸18.5mL
蒸餾水24mL，總體積為99mL pH6.0
吖啶橙母液：
用吖啶橙/蒸餾水配成1mg/mL(致癌物，應(yīng)小心)，吖啶橙應(yīng)用液0.1mL母液加9.9mL溶液B稀釋。
注意：儀器鞘流系統(tǒng)應(yīng)保持4℃。
氬激光激發(fā)波488nm，紅色熒光為DNA(F>600nm),綠色熒光為RNA或單鏈DNA(F>530nm)
(2)方法
①用含15%血清的PBS配制細(xì)胞懸液，取0.2mL(8×106細(xì)胞/mL)，加入0.4mL溶液A，4℃放置45～60秒。
②加1.2mL含吖啶橙的溶液B，室溫2分鐘。
③應(yīng)在加入溶液B后10分鐘內(nèi)進(jìn)流式細(xì)胞儀分析。
注意：①細(xì)胞數(shù)保持恒定；②核酸與吖啶橙的比例；③染色時(shí)間及溫度。
(三)染色法的應(yīng)用
1、變性及雙鏈DNA的鑒別染色
(1)試劑：
HBSS內(nèi)含1000u/mL RNA酶A，0.2mol/L KCl pH1.35
吖啶橙用0.1mol/L檸檬酸配成5 mg/L(16.7μm),0.2mol/L Na2HPO4緩沖液，pH2.6。
①2×106細(xì)胞懸于1mL HBSS/RNase液中。
②37℃溫育1小時(shí)。
③將0.2mL細(xì)胞懸液(含4×105細(xì)胞始終懸浮于HBSS/RNase)與0.5mL 0.2mol/L KCl(pH1.35)混勻，20℃ 30分鐘。
④加2mL吖啶橙染色2分鐘。
⑤綠色熒光(530nm)和紅色熒光(600nm)分別代表細(xì)胞中單鏈及雙鏈DNA含量。
2、DNA與癌基因探針雙標(biāo)記測定
這種測定是先用癌基因探針按間接免疫熒光染色法標(biāo)記癌基因表達(dá)產(chǎn)物，然后用PI標(biāo)記DNA，現(xiàn)以研究白血病細(xì)胞增殖與癌基因的關(guān)系說明操作步驟：
(1)制備白血病細(xì)胞懸液，用100%甲醇在-20℃固定10分鐘。
(2)取50μl50 mg/L的癌基因探針Y13-25(它是一種廣譜單克隆抗體，可特異性地直接與N-ras，Ki-ras和Ha-ras三種癌基因編碼的21Kd蛋白相結(jié)合)，4℃作用30～45分鐘。
(3)用PB離心洗滌2次，重懸浮于50μL HBSS中(含0.1%疊氮鈉和2%小牛血清)。
(4)加入50μL 1:200兔抗鼠IgG，4℃放置30～45分鐘。
(5)同(3)洗滌后加入50μL 1:40的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，4℃反應(yīng)30～45分鐘。
(6)同(3)洗滌后，細(xì)胞用RNA酶消化，室溫20～30分鐘。
(7)同(3)洗滌后，用PI染液染20分鐘。
(8)同(3)洗滌后，用488nm激發(fā)波長測定。FITC染色顯示ras癌基因表達(dá)產(chǎn)物，PI染色顯示DNA含量。
注意事項(xiàng)：
①制備樣品時(shí)，離心次數(shù)不宜過多，防止細(xì)胞丟失和凝集；
②細(xì)胞固定時(shí)間不宜過長，不要用冰醋酸、乙醇、苦咪酸及汞固定劑；
③為了降低本底，應(yīng)將細(xì)胞表面未結(jié)合的熒光染料洗凈；
④進(jìn)行雙標(biāo)記沉淀時(shí)，應(yīng)盡量選用激發(fā)光譜不接近的熒光色素。
3、以溴化脫氧尿嘧啶(Brdu)和Hoechst33258染料進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
(1)試劑：
用培養(yǎng)基配制33 mg/L Brdu及脫氧細(xì)胞苷26.4g/mL。
染色液：Hoechst33258溶于PBS，細(xì)胞染色24小時(shí)后進(jìn)行分析，據(jù)報(bào)道染色的穩(wěn)定時(shí)間在30分鐘至24小時(shí)之間。
(2)方法：
①將Brdu溶液按1:10加入細(xì)胞培養(yǎng)液中。
②根據(jù)細(xì)胞周期時(shí)間不同，選擇不同時(shí)間培養(yǎng)的細(xì)胞。
③孵育后，搖散細(xì)胞以傳代培養(yǎng)。
④直接用染液重懸細(xì)胞，進(jìn)入流式細(xì)胞儀分析。
Hoechst33258熒光值在410～580nm之間，需用330～360nm紫外光激發(fā)。應(yīng)特異性結(jié)合腺嘌呤-胸腺嘧啶堿基對。因此，不僅特異性標(biāo)記DNA，亦可標(biāo)記胸腺嘧啶。在細(xì)胞周期分析時(shí)，在與細(xì)胞孵育過程加入Brdu,Brdu可替代DNA中的胸腺嘧啶，因此，處于合成期內(nèi)的細(xì)胞表面上仍保持二倍體狀態(tài)，并在分裂后G1峰的半峰處產(chǎn)生一新峰，此項(xiàng)技術(shù)可用于直接測定細(xì)胞G2期及分裂時(shí)間。
4、Hoechst33342染色活細(xì)胞DNA
(1)試劑：Hoechst 33342,用蒸餾水配成0.25mol/L。
(2)方法：
①制備106/m細(xì)胞懸液，以Hoechst33342染色，濃度為5～10 mg/L ，室溫下20分鐘。
②分析前切勿洗滌細(xì)胞。
Hoechst33342可用作細(xì)胞DNA的活體染料，據(jù)信可在保持細(xì)胞活性的同時(shí)，呈現(xiàn)出相當(dāng)好的DNA化學(xué)計(jì)量關(guān)系，激發(fā)波在紫外范圍350～363nm之間，發(fā)射波則在450nm處。
5、以異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyante FIFC）染色蛋白質(zhì)。
(1)試劑：異硫氰酸熒光素(FIFC)用含40 mg/L RNase的PBS配成0.1～1.0 mg/L濃度。
(2)方法：
①染色前用終濃度70%乙醇固定細(xì)胞，至少18小時(shí)。
②離心固定細(xì)胞，棄去固定液。
③室溫下用FIFC染色細(xì)胞蛋白，30分鐘。
④流式細(xì)胞儀分析，使用氬激光，激發(fā)波長488nm，熒光發(fā)射波長515～535nm。
也可于固定細(xì)胞中，以18 mg/L (0.1%檸檬酸鹽配制)和0.05 mg/L FIFC(含40 mg/L RNase，PBS配制)染色20分鐘以上可對DNA和蛋白質(zhì)雙重染色，分別呈現(xiàn)紅色熒光（DNA）和綠色熒光（蛋白質(zhì)）。
6、熒光素抗體的應(yīng)用
該技術(shù)既可用于檢測帶有特異性膜抗原的細(xì)胞，可用熒光素或若丹明標(biāo)記單克隆抗體處理上述細(xì)胞；也可用于測定胞漿中的蛋白質(zhì)(如凋亡BCL-2蛋白，抗病毒蛋白MXA等)。
用磷酸鹽緩沖液Eagle's MEM稀釋FIFC連接的抗體內(nèi)含0.1%疊氮鈉、2%牛血清。為判定FIFC抗體的最適度的稀釋濃度，向微量滴定板的細(xì)胞中加入50μL不同濃度的稀釋液，再以熒光顯微鏡確認(rèn)最佳染色濃度。使用抗人LEU-I抗體分析時(shí)，應(yīng)稀釋成5 mg/L或 0.25 mg/L。無論鼠或人細(xì)胞在2×107濃度時(shí)其存活率應(yīng)在90%以上。
方法：
(1)于微量滴定板加入50μL抗體稀釋度，再加入50μL細(xì)胞懸液，混勻。
(2)冰浴45分鐘，離心滴定板（1500r/min 10分鐘）。
(3)棄上清，以培養(yǎng)基100μL洗滌細(xì)胞沉淀2次，每次洗滌后用1500r/min 10分鐘，棄上清。
(4)以1ml預(yù)冷的培養(yǎng)基配成1×106細(xì)胞/mL的已染色細(xì)胞懸液，進(jìn)樣前持續(xù)保持冷環(huán)境(4℃)。


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文字是人類用符號記錄表達(dá)信息以傳之久遠(yuǎn)的方式和工具?，F(xiàn)代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產(chǎn)生書面文字，很多小語種，有語言但沒有文字。文字的不同體現(xiàn)了國家和民族的書面表達(dá)的方式和思維不同。文字使人類進(jìn)入有歷史記錄的文明社會。
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